多发性骨髓瘤患者样本和 FACS
手脚临床惯例的一部分，在佳学基因相助病院收罗了多发性骨髓瘤患者的骨髓样本。患者材料的收罗和使用需得回方位病院伦理审查机构的批准，并凭据赫尔辛基宣言进行。为了分析纯化的细胞亚群，细胞使用 FACS ARIA IIu 分选仪 (BD Biosciences) 进行 FACS。在分选经过继承碘化丙啶 (PI) 甩掉死细胞。使用 CD319 抵偿冷冻保存材料上 CD138 的亏损，接受 FACS 的多发性骨髓瘤细胞被分选为为 PI - CD14/CD16/CD11b - CD3 - CD319 + CD38 +. 此外，CD138、CD19、CD45 和 CD56 用于凭据抒发界说多发性骨髓瘤细胞。接受 FACS 的粒细胞和 T 细胞的分选尺度分裂为 PI - CD14/CD16/CD11b + CD3 - CD19 - CD56 - CD319 - CD45 + CD38 -和 PI - CD14/CD16/CD11b - CD3 + CD19 - CD56 - CD319 - CD45 + CD38 -。
FISH基因检测
使用针对 t(4;14)、t(14;16)、t(11; 14 )、 1q21、4p16、6q21、8p12、9p21、11q13、13q14、13q34、14q32 、 15q22、16q23、17p13 和 19q13的探针进行FISH基因检测。
lrWGS
在制备测引言库时，将 200 至 240 个经过 FACS 解决的细胞分选到 8 μL 含 2% 胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水中；将管少顷脉冲旋转，在干冰上冷冻，并储存在-80°C直至使用。为了使细胞变性并使基因组 DNA 易于获取，使用窄孔吸头添加 2 μL 0.25N NaOH，并通过留神轻弹试管来夹杂样品。在室温下孵育 5 分钟后，将 97.5 μL 样品主夹杂物（89.5 μL 基因组试剂夹杂物、3 μL 添加剂 A 和 5 μL 基因组酶夹杂物；Chromium Genome Reagent Kit [v2 Chemistry]）添加到具有窄孔先进的变性细胞。随后，AG真人百家乐使用大口径吸头轻轻移液夹杂样品。将统共 90 μL 的样品夹杂物（含有约 1.2 ng DNA）加载到 Chromium 基因组芯片上，其余门径凭据产物诠释（手册 CG00043 Rev B）履行。使用 Qubit dsDNA HS 试剂盒（Invitrogen）对条形码文库进行量化，清除，并使用 Illumina 平台（Novaseq；Illumina，San Diego，CA）进行配对结尾测序（2×150 个轮回）。
使用 Long Ranger 解决数据，输出文献用于下流分析。简而言之，染色体数是使用 BarCrawler ( https://github.com/J35P312/BarCrawler ) 纠合里面剧本计较的；关于选择样本，还使用 CNVkit (v0.9.8)、 ASCAT (v2.5.2)、和 Battenberg 要领 (v2.2.9)评估了染色体数量；使用 FindSV ( https://github.com/J35P312/FindSV ) 和 Long Ranger 调用 CNV；体细胞变异调用是使用 nf-core/Sarek 分析决策（v2.6 ；使用 Strelka2 [v2.9.10] 和 Mutect2 [GATK v4.1.7.0] 手脚得回基因突变位置）和 VEP (v99.2) 和 SnpEff (v4.3t) 的组合用于变体细心；使用 GROC-SV (v0.2.5) 纠合 Long Ranger 识别 SV；并在Loupe和 IGV 中目视考据SV。
RNA测序
链特异性 RNA 测序数据是从多发性骨髓瘤细胞生成的。使用 STAR (v2.5.2b) 将测序数据与hg38进行比对，使用 HOMER 量化外显子中的46 个读数，使用 R 计较每百万转录本 (TPM)。
ChipSeq
使用 H3K27Ac 抗体（批次 A1723-0041D/2；目次号 #C15410196；Diagenode）对 20000 个用于FACS的多发性骨髓瘤细胞进行染色质免疫千里淀测序（ChIPseq）。但对对照的制备进行了轻捷修改。使用 bowtie2 将 Fastq 文献匹配到到hg38，并使用 HOMER、 DEseq2和 R 进行下流分析。
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